Extracción de ácidos nucléicos
La extracción de los ácidos nucléicos (ADN y ARN) es el primer paso para poder utilizar un marcador molecular.
Los pasos a seguir junto a su explicacion son los siguientes:
a) Introducir una hojita pequeña de tomate en cada tubo.
Si es demasiado grande se coge un trozo.
b) Añadir 250 µl de tampón de extracción (Tris 100 mM pH 8, EDTA 50 mM pH 8 y NaCl 500 mM).
c) Triturar con un “palito azul” hasta que no queden restos de hoja.
d) Añadir 250 µl de tampón de extracción. Mezclar con el palito.
Hasta aquí, lo que hemos realizado ha sido simplemente romper la membrana plasmática y pared celular por medio de movimientos mecánicos y quimicos (EDTA) mientras que el Tris mantiene el pH y protege al ADN de otros acidos
e) Añadir 35 µl de SDS. Agitar suavemente para no formar demasiada espuma.
f) Incubar los tubos a 65 ºC durante 5 minutos.
g) Añadir 130 µl de acetato de potasio 5 M.
h) Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
i) Centrifugar los tubos a 13.000 rpm durante 10 minutos.
Hasta aquí, se aplica SDS que elimina el resto de orgánulos que no tienen utilidad en esta ractica a continuacion se aumenta la temperatura para anular las enzimas que se encargan de romper los acidos y nucleicos, y se aplica acetato de potasio para equilibrar el pH, y se centrifuga para que sea uniforme
j) Pasar el sobrenadante (500 µl) a otro tubo limpio, rotulado convenientemente. Procurar no arrastrar restos.
k) Añadir 500 µl de isopropanol y 60 µl de acetato de sodio 3 M.
l) Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
m) Centrifugar los tubos a 13.000 rpm durante 10 minutos.
n) Eliminar la mayor cantidad posible del líquido sobrenadante, sin arrastrar el precipitado.
o) Añadir 300 µl de etanol al 70 %. Golpear el tubo para que el precipitado se desprenda del fondo. p) Centrifugar los tubos a 13.000 rpm durante 5 minutos.
Hasta aquí, lo que realizamos es deshacer la membrana nuclear mediante el acetato de sodio y utilizar alcoholes en los que los acidos nucleicos son insolubles para hacerlos visibles
q) Eliminar la mayor cantidad posible de alcohol. Si queda, dejar los tubos abiertos para que se evapore.
r) Una vez que esté completamente seco se resuspende, añadiendo una pequeña cantidad de agua estéril (30 a 100 µl).
Finalmente, se drena el líquido sobrante y se introduce la muestra en agua estéril para su posterior almacenamiento
La extracción de los ácidos nucléicos (ADN y ARN) es el primer paso para poder utilizar un marcador molecular.
Los pasos a seguir junto a su explicacion son los siguientes:
a) Introducir una hojita pequeña de tomate en cada tubo.
Si es demasiado grande se coge un trozo.
b) Añadir 250 µl de tampón de extracción (Tris 100 mM pH 8, EDTA 50 mM pH 8 y NaCl 500 mM).
c) Triturar con un “palito azul” hasta que no queden restos de hoja.
d) Añadir 250 µl de tampón de extracción. Mezclar con el palito.
Hasta aquí, lo que hemos realizado ha sido simplemente romper la membrana plasmática y pared celular por medio de movimientos mecánicos y quimicos (EDTA) mientras que el Tris mantiene el pH y protege al ADN de otros acidos
e) Añadir 35 µl de SDS. Agitar suavemente para no formar demasiada espuma.
f) Incubar los tubos a 65 ºC durante 5 minutos.
g) Añadir 130 µl de acetato de potasio 5 M.
h) Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
i) Centrifugar los tubos a 13.000 rpm durante 10 minutos.
Hasta aquí, se aplica SDS que elimina el resto de orgánulos que no tienen utilidad en esta ractica a continuacion se aumenta la temperatura para anular las enzimas que se encargan de romper los acidos y nucleicos, y se aplica acetato de potasio para equilibrar el pH, y se centrifuga para que sea uniforme
j) Pasar el sobrenadante (500 µl) a otro tubo limpio, rotulado convenientemente. Procurar no arrastrar restos.
k) Añadir 500 µl de isopropanol y 60 µl de acetato de sodio 3 M.
l) Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
m) Centrifugar los tubos a 13.000 rpm durante 10 minutos.
n) Eliminar la mayor cantidad posible del líquido sobrenadante, sin arrastrar el precipitado.
o) Añadir 300 µl de etanol al 70 %. Golpear el tubo para que el precipitado se desprenda del fondo. p) Centrifugar los tubos a 13.000 rpm durante 5 minutos.
Hasta aquí, lo que realizamos es deshacer la membrana nuclear mediante el acetato de sodio y utilizar alcoholes en los que los acidos nucleicos son insolubles para hacerlos visibles
q) Eliminar la mayor cantidad posible de alcohol. Si queda, dejar los tubos abiertos para que se evapore.
r) Una vez que esté completamente seco se resuspende, añadiendo una pequeña cantidad de agua estéril (30 a 100 µl).
Finalmente, se drena el líquido sobrante y se introduce la muestra en agua estéril para su posterior almacenamiento
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